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質(zhì)粒DNA提取不管小提大提都離不開(kāi)它
發(fā)布時(shí)間：
2020-12-09
概要：
離心機(jī)在質(zhì)粒DNA提取中有著很重要的地位，而且操作流程復(fù)雜。
因?yàn)橘|(zhì)粒DNA作為基因重組與基因轉(zhuǎn)移的載體，在遺傳工程研究中很重要。
所以在日常的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)用到質(zhì)粒DNA，現(xiàn)在都用劑盒非常方便，而且菌體培養(yǎng)后，可以多管濃縮提取，提到的質(zhì)粒量多，可以-20℃保存，以后用于酶切、轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)，可以提前跑個(gè)膠，只要不降解，就可以繼續(xù)用，避免每次要用，都要培養(yǎng)一遍再提取一遍。
質(zhì)粒DNA常見(jiàn)的提取方式分為兩種：
一.質(zhì)粒小提
將之前準(zhǔn)備的LB液體培養(yǎng)基中加入抗性(氨芐1：1000)，取15ml 離心管，加入5ml 已加入抗性的液體培養(yǎng)基。
用小白Tips從平板中挑選單克隆，將小槍頭打入15ml 離心管中，30℃，180rpm，搖 >5h，以看到液體培養(yǎng)基變渾濁為準(zhǔn)。
取干凈的1.5ml EP管，從15ml 離心管中吸取1.5ml(這個(gè)量可根據(jù)菌液混濁程度加減)菌液，離心機(jī)12000rpm，離心3min。
棄上清，加入250ul TIANGEN質(zhì)粒小提Kits(Cat# DP103-03，Lot# 6123)P1液，震蕩，徹底混勻。
加入250ul P2液，溫和(以免DNA斷裂)翻轉(zhuǎn)6-8次，使菌體充分裂解。（這一步總時(shí)間不要超過(guò)5min，防止過(guò)度裂解，質(zhì)粒受到破壞）
向EP管中加入350ul P3液，立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)可看到白色絮狀沉淀，離心機(jī)12000rpm，離心3min。（P3加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀，若上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清）
將吸附柱CP3(實(shí)驗(yàn)前用平衡液BL處理吸附柱可最大限度激活硅基質(zhì)膜，提高得率；BL處理過(guò)的吸附柱最好當(dāng)天使用，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響效果)放在收集管中，將上清轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，盡量不要吸到沉淀，離心機(jī)12000rpm，離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管。
可選步驟：向CP3中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm，離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管。（如果宿主菌是end A+ 宿主菌TG1、BL21、HB101、JM系列、ET12567等，因其含有大量核酸酶，所以推薦此步驟；若為end A- 宿主菌DH5α、TOP10等，可省略此步）
向CP3中加入600ul 漂洗液PW(已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm，離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管。
重復(fù)步驟9。
離心機(jī)12000rpm，離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去掉。
將CP3吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5ml EP管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100ul洗脫液EB，室溫放置2min，12000rpm，離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到EP管中。（為增加質(zhì)粒得率，可將溶液再次加入吸附柱CP3，室溫放置2min，12000rpm，離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到EP管中；也可以提前65-70℃預(yù)熱EB液）
測(cè)濃度，跑膠看提取質(zhì)粒的質(zhì)量。
二.質(zhì)粒大提,操作這一步前一般要質(zhì)粒小提確認(rèn)質(zhì)粒的質(zhì)量。
取潔凈的錐形瓶，加入小提步驟1中的LB液體培養(yǎng)基100ml，取小提步驟2中的菌液10ul 加入錐形瓶中，30℃，180rpm，搖過(guò)夜，以看到液體培養(yǎng)基變渾濁為準(zhǔn)。
保存菌種：用15%的甘油保存菌種：1.5ml EP管中加入350ul 菌液+150ul 50%甘，混勻，-80℃保存。
將錐形瓶中剩下的菌液用50ml 離心管，4℃，8000rpm，離心5min，收集菌體沉淀，可同管多次。
根據(jù)所選大提試劑盒的說(shuō)明書(shū)按步驟提取，不同試劑盒步驟不一樣。
提取結(jié)束后測(cè)濃度，跑膠（因質(zhì)粒分子量一般較大，所以用低濃度的瓊脂糖膠和大的marker）
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