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      免疫沉淀沒有它無法實現(xiàn)

      發(fā)布時間:

      2021-01-04


      概要:

      今天要來講講離心機在免疫沉淀方面得重要性。據(jù)了解染色質(zhì)免疫沉淀簡稱ChIP用來研究DNA上的特定蛋白質(zhì)。

        今天要來講講離心機在免疫沉淀方面得重要性。

        據(jù)了解染色質(zhì)免疫沉淀簡稱ChIP用來研究DNA上的特定蛋白質(zhì)。

        而RNA免疫沉淀法(RIP)和ChIP相近,但RNA免疫沉淀法是用來研究會與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)(RNA Binding ProteinImmunoprecipitation,RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀),是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù),利用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,通過離心機分離純化,對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行RT-PCR驗證或測序分析,了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程,是研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具,能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。

        RIP這種新興的技術(shù)運用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用,但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物,RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同(如復(fù)合物不需要固定,RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶,抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等)。

        RIP技術(shù)下游結(jié)合microarray技術(shù)被稱為RIP-Chip,幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化,結(jié)合的RNA序列通過microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。

        免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法??贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后,再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育,通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物,沉淀經(jīng)過洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,通過離心機離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

        免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法,是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。

        免疫共沉淀實驗大致流程為:收集蛋白樣品—誘餌蛋白抗體沉淀誘餌蛋白—SDS-PAGE 分離蛋白—WB 檢測是否存在靶蛋白。

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        操作步驟

        1.一般起步使用2個10cm2皿,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞三次,最后一次吸干PBS;

        2.加入細(xì)胞裂解液(western及IP裂解液)裂解細(xì)胞,使蛋白終濃度在1-7mg/ml;

        3.4°離心10min,去除細(xì)胞碎片;注意這里需要用到冷凍離心機,因為溫度上有嚴(yán)格要求。

        4.根據(jù)樣品量加入0.5-2ug左右抗體,4℃,旋轉(zhuǎn)過夜。

        5.取10-30ul protein A/G 的beads于EP管中,棄上清,使用PBS洗滌beads一次。

        6.將樣品加入EP管,4度垂直混勻2-3h。(在吸取瓊脂糖珠的時候,注意要搖勻管子,讓珠子和溶液混合均勻,同時黃槍頭要減掉頭子再吸取,以免破壞珠子),PBS洗脫;4度離心,棄上清,

        7.洗脫三次,酌情用PBS/PBST/高鹽溶液洗瓊脂糖珠,最后一次吸干洗滌液。

        8.將適量相應(yīng)抗體的多肽或0.1M PH2.8的甘氨酸稀釋到細(xì)胞裂解液中,混勻,取適量于beads中進(jìn)行洗脫,去除輕重鏈。若用甘氨酸HCL,樣品需要用NaOH中和,根據(jù)C1V1=C2V2計算加入NaOH的含量。

        9.通過離心機離心取上清,制樣,跑膠。

        以上就是關(guān)于離心機在免疫沉淀方面得講解,現(xiàn)在您知道“免疫沉淀沒有它無法實現(xiàn)”中得"它"說的是什么了吧!


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